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与此同时，共产党的态度也发生了变化。到达武昌的鲍罗廷，联合西路军的唐生智，明确了反蒋姿态。蒋介石则派人到苏联劝说斯大林等继续维持与蒋合作的路线。而为了巩固自己的统治地位，蒋介石又将一直支持江西国民党组织的中共党员排挤出国民党外。也就是说共产党与蒋介石的意见分歧，被蒋介石巧妙利用，而中共方面没有能够采取有效的对策。
另一方面，毛泽东在辞去国民政府代理宣传部长后，转为担任国共合作下成立的农民运动讲习所的所长。当时，中国共产党的工作重心主要在城市里的工人运动。而出身湖南湘潭农村的毛泽东，从农村人口占绝大多数的中国的现状出发，主张国民革命必须首先是农民革命，只有解决农民问题，获得农民支持，国民革命才能成功。青年时代的毛泽东，反抗富农出身的父亲，投身于新文化运动。他认为，不消灭农村的封建势力就无法彻底打垮军阀和帝国主义的统治。
北伐开始后，在国民革命军占领区，毛泽东的弟子们深入农村，开展农民运动。在湖南，两百多名党员在各地设立农民协会，发展了超过两百万人的会员。他们在农村实行孙中山在国共合作时期认可的减租减息政策，冲击一切封建宗法制度，如破除祭祖、祭神等传统习惯，颠覆族权、父权为代表的传统社会秩序。他们还建立农民武装，组织农民自卫军。部分地区的农会成员还参与县政。到湖南考察农民运动的毛泽东写出了经典之作《湖南农民运动考察报告》。
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在报告中，毛泽东承认农民运动中存在过分的行为。比如把没有多少土地的人也定为“土豪”，把穿长衫的人都称为“劣绅”等等。另外，报告也记录了国民党和部分共产党员对农会的批评。比如批评农会动不动捉“土豪劣绅”戴高帽游乡，甚至任意处刑，是“矫枉过正”的行为。
82 青年时代的毛泽东
针对这些批评，毛泽东在报告中进行了反驳。他说：“革命不是请客吃饭，不是做文章，不是绘画绣花，不能那样雅致，那样从容不迫，文质彬彬，那样温良恭俭让。革命是暴动，是一个阶级推翻一个阶级的暴烈的行动。”“现在农民起来枪毙几个土豪劣绅，造成一点小小的镇压反革命派的恐怖现象，有什么理由说不应该？”
从今天的角度来看，毛泽东的主张很容易受到批判。他在报告中说湖南军人唐生智支持对土豪劣绅的肃清。但其实是因为最先被杀的都是反对唐生智的人。另外，农民协会在乡村独裁，任意实施逮捕和处刑，最后发展到连共产党都无法控制，甚至省级官员被枪毙的事件都有发生。与国民革命军进驻大城市不同，农村地区很难切实感觉到革命到来的氛围。而太平天国的《天朝田亩制度》中包含的平均主义的乌托邦理想则很容易打动底层农民。
把毛泽东的行为与蒋介石做一比较，可以看出他们有一个共同点。即，无论是蒋的倚重军队也好，还是毛的重视群众运动也好，他们都认为武力是解决问题的关键。而崇尚武力并不仅仅是他们两人的特征。戴季陶在《日本论》中也主张：“我们看见日本民族种种历史上的思想，看见日本维新的思想根据，使我们愈加了解‘武力’和‘战争’这一个事实是建国的最要紧的手段。不经过很多的恶战苦斗，费过很大的牺牲，民族的平等、国家的独立是决计得不到的。”
这些事实既反映出他们是那个时代的代言人，同时也揭示了在中国社会的底层积压着一股近似野蛮的能量，就如同义和团运动中所爆发出来的那样。国民革命取得胜利正是借助了这种能量。而这股蠢蠢欲动的能量，与打倒帝国主义的民族主义潮流一齐喷发，引起了激烈的连锁反应。这就是南京事件与四一二政变。
四一二政变与国共合作破裂
南京事件与蒋介石
1927年3月24日，北伐军攻占南京。在到领事馆避难的日本侨民中，却丝毫没有紧张气氛。因为当时北伐军的口碑相当好，所以侨民们认为北伐军不会像孙传芳部那样有抢劫行为。但是，次日早晨，北伐军以搜捕战犯为名，闯入领事馆，开枪威胁馆内人员，并与部分南京市民开始进行抢劫。南京的英、美两国领事馆也同样遭到袭击。于是英美军舰向南京市内开炮，造成人员伤亡，此即南京事件。
而类似事件也在中国各地频频发生。1927年1月，在湖北汉口的英租界，由中国人被杀事件引发大规模反英运动。刚刚成立的武汉国民政府借机收回了汉口和九江租界。但是，国民革命的口号本来就是打倒帝国主义。而北伐军的胜利，更点燃了中国人的民族主义热情。袭击领事馆、外国人寓所及基督教会的事件时有发生。
此时，日本没有像英美两国那样采取报复性攻击。日本外相币原喜重郎认为，与北京政府相比，蒋介石更有能力统治东北三省以外的中国。因此，日本政府仅要求中方惩罚参与暴行的士兵和对受害者进行赔偿，以及要求蒋介石压制共产党势力、保障各国在上海的利益与安全。但是，日本军部则批评政府的态度是软弱外交，上海的日本人团体也主张应向武汉政府表示强硬抗议。结果，首相若槻礼次郎被迫辞职，主张强硬外交的田中义一内阁上台。
另一方面，美国认为南京事件是让蒋介石与苏联分手的机会。国务卿凯洛格发表“新对华计划”，表示美国将向蒋介石提供财政援助，镇压共产党活动，美国还将督促蒋介石与张作霖停战，以实现南北共同取缔共产党。对此，蒋介石发表声明，表示要坚持国共合作。同时，他也向共产党发出不得破坏“国民革命伟业”的警告。对于蒋介石来说，他无法忽视列强要求他与共产党和苏联诀别的压力。
中共领导的上海武装起义与四一二政变
国民革命军继续北上期间，中共为反对统治上海的军阀孙传芳，在上海发动了数次武装起义。特别是1927年3月，在东路军白崇禧（新桂系）率部迫近上海之时，21日，中共在青帮首领杜月笙的协助下，策动了八十万人参加的总罢工。工人武装组织纠察队更攻打并占领了警察局和守备队兵营，次日在上海成立了自治政府。
3月26日，蒋介石抵达上海。资本家组织上海总商会要求蒋介石尽快稳定局面。其中最为积极的是代表浙江财阀的宋氏家族的长女宋霭龄。宋霭龄承诺为蒋介石个人提供财政援助，同时希望蒋介石阻止工人收回上海租界的运动，以免妨碍中外贸易。事实上，中共领导的上海总工会主张上海由工人自治，正计划举行大规模罢工和进攻租界等活动，并组织了反蒋运动。
3月28日，国民党召开中央监察委员会，对中共的“过激”行为进行了批判。会议主席是辞去北京大学校长一职的国民党元老蔡元培。受克鲁泡特金的无政府主义影响，蔡元培提倡互助论，主张非暴力，反对马克思主义的阶级斗争论。会上，国民党批评共产党破坏国民革命，蔡元培对此表示赞成，并亲自作了报告，同意拘捕和监视共产党员。
这样，蒋介石在受到各方压力及接到各种要求之下，终于决定与共产党彻底决裂。他命令白崇禧对上海实施戒严令，同时与杜月笙秘密接触，断除青帮对中共的支援。4月9日，蒋介石把亲共军队调去南京，自己也离开上海到南京，镇压中共的污名就丢给了白崇禧和杜月笙。
83 杜月笙
但中共方面却没有认识到形势的紧迫。其主要原因在于，4月1日，在法国休养的汪精卫经由海参崴返回上海，在与蒋介石协商后，汪精卫与陈独秀发表了联合宣言，强调国共继续合作。但是，汪在4月6日即出发赴武汉，没有能够阻止对共产党的镇压。使得气氛紧张的反而是6日在北京发生的事件。张作霖攻进北京的苏联大使馆和共产党支部，逮捕了李大钊等共产党员，取缔共产党的局势恶化了。
1927年4月12日清晨，白崇禧下令解除工人纠察队武装。而实际上，前一日的夜里，上海总工会主席就被杜月笙暗杀。国民党的策略是先由青帮袭击纠察队，然后国民革命军出动，以仲裁为名解除工人武装。但最后演变为青帮与国民革命军共同袭击纠察队，一百二十名工人在枪战中被杀，手枪、机关枪等三千余支武器被收缴。
13日，上海总工会组织总罢工。下午，工人、学生开始游行，要求收回工人武装等。游行队伍行至宝山路时与国民革命军发生冲突，国民革命军向游行队伍开枪，死伤者不计其数。目睹这场血案的上海知识界向蔡元培等人发出抗议信，并在报纸公开发表。但是，4月15日，蔡元培等人在中央监察委员会会议上对白崇禧排除“反革命分子（共产党）”的决定表示赞同。北京的周作人（鲁迅之弟）指出，对四一二清党运动，蔡元培等人难逃其责。
事件发生后，共产国际在4月14日发表声讨蒋介石的宣言。18日，以汪精卫为代表的武汉国民政府宣布开除蒋介石的国民党党籍，并向他发出逮捕令。但是武汉政府不具备与蒋进行军事对抗的实力。蒋介石方面同样于18日在南京成立由胡汉民任主席的南京国民政府。双方在继续进行北伐的同时，形成了宁汉对峙的局面。而中共方面则试图重建上海的共产党组织，但4月25日以后又开始了对共产党员的大清洗运动，共产党组织受到严重破坏。
国共合作的破裂与鲁迅
4月15日，上海发生的政变也波及广州。当日清晨，许广平家的佣人来报信，说中山大学校园内贴满了大字报，内容牵涉到鲁迅，叫他快逃走。震惊的许广平察看外面的情况，果然看到路上都是待命军队。广州市内被封锁，共产党团体和工会等遭到袭击，遇害者众多。中山大学也有四十余名共产党员被捕。
下午，中山大学召开系主任紧急会议，鲁迅冒雨赶往学校，并在会上呼吁营救被捕学生。但是中大副校长朱家骅说：“这里是‘党校’，凡在这里做事的人，都应服从党国的决定，不能再有异议”，拒绝了这一要求。愤怒的鲁迅拍案而起，质问在场教授：“请问，被抓去的学生都犯了什么罪？”但无一人响应。当晚，回到家中的鲁迅愤而绝食。
随后，对共产党的镇压活动愈演愈烈。4月18日，鲁迅的好友，中山大学的共产党人毕磊被捕。鲁迅在文中写道：“据我的推测，他一定早已不在这世上了，这看去很是瘦小精干的湖南的青年。”6月，中山大学以“共产分子”为名，开除和辞去了数十名学生和员工。鲁迅也主动提出辞职，9月与许广平同赴上海。
此时，武汉国民政府也发生了重大变化。与占据东南沿海富庶之地的南京国民政府相比，武汉国民政府的财政非常拮据。苦于资金的武汉政府，希望减少工人运动，以恢复生产，增加税收。但是，由于中共对工人统率不利，未能收到效果。实际上，只得通过在各地没收与吴佩孚有牵连的人的财产来保证税收。
而造成武汉政府内部产生深刻裂痕的是，围绕军粮发生的军队与农民协会的冲突。1927年5月发生的马日事变就是在此背景下发生的。唐生智下属部队在湖南长沙袭击农民协会，解除了农民自卫军和工人纠察队的武装。
以往的研究认为，这一事变是部分军官对武汉国民政府产生动摇，倒向反共阵营的结果。但实际原因在于农民协会禁止谷米流通，造成军米不足，甚至还发生农民将保护军米的士兵杀死，抢回已售出的军米等事件。另外，在打击“土豪劣绅”的过程中，不少国民革命军官兵的财产也被没收，家属受到迫害。
不过，当时中共的报告中说，屠杀军官家属的是秘密帮会哥老会的成员，他们实际把持着农民协会的内政。而中共领导层中也确实有出身秘密帮会者，如英勇善战的贺龙、彭德怀等。后来，这些人在毛泽东建立江西井冈山革命根据地过程中，发挥了重要作用。但马日事变当时，对这些以往饱受压抑的人在参加革命同时所爆发出来的负面能量，中共还没有能力控制。
这样，武汉国民政府事实上已经陷入了自我瓦解的境地。1927年6月，共产国际代表罗易要求陈独秀等人执行共产国际的指示，要求中共继续留在武汉政府，同时开展土地革命，组织工农武装。但这一指示完全脱离中国实际，鲍罗廷也认为无法实施。于是，共产国际又于7月发出新的指示，要求中共不退出国民党，但必须退出武汉政府。在共产国际的压力下，中共只得宣布退出武汉国民政府，中共党员纷纷辞去在武汉政府的职务。而汪精卫等人已然对国共合作感到疲倦之极，中共的退出恰好为分共制造了机会。
1927年8月1日，退出武汉政府的共产党员联合一部分国民革命军，以国民党革命委员会的名义，在江西南昌举行起义。南昌起义是中共独立领导的行动，起义前并没有考虑胜算，而仅仅是为了显示共产党员贯彻国民革命的气概。结果，起义以中共军队大败告终，武汉国民政府以此为借口开始大规模镇压共产党。9月，武汉政府与蒋介石的南京国民政府合并，即宁汉合流。
至此，维持了近四年的第一次国共合作破裂，承继孙中山遗志的国民革命也在途中受挫。对终止国共合作一直持保留态度的蒋介石，最终选择与共产党决裂，这使他获得了国内外各界势力的支持，帮助他迅速完成了北伐。但是，这种迟疑使得革命形势不明朗，造成了许多人的无谓牺牲。
